Ferramentas genéticas ajudam a identificar espécies de fungos

#Ciência et al. (Especiais temáticos repletos de informações científicas)

Como PCR e técnicas afins podem ajudar a identificar fungos com impacto sobre nossa saúde e produções agrícolas?

DESTAQUES:
– Fungos são seres vivos com diferentes interesses para nós, alguns positivos, outros negativos;
– Alguns são utilizados como fermentos, outros nos causam doenças, e outros atacam nossos alimentos e outras produções agrícolas;
– A identificação de fungos microscópicos pode ser difícil, mas técnicas como qPCR podem nos ajudar;
– Técnicas assim ainda está sendo melhoradas, e um grande limitante para sua aplicação é o custo.

Fungos são organismos normalmente pensados e retratados pela imagem dos cogumelos, aquelas estruturas macroscópicas encontradas na natureza ou em comidas orientais. No entanto, poucos sabem que existem inúmeros outros tipos de fungos que estão presentes em nosso dia a dia, fazendo parte de nossa microbiota natural, por exemplo. Além de muitos vírus (como o coronavírus) e bactérias, muitos fungos são também importantes patógenos humanos ou causam danos e prejuízos à agricultura e à indústria.

Diferentes espécies de fungos estão presentes no processo de manufatura do pão, em alimentos embolorados, ou na frieira, decorrente de horas usando calçados fechados sem secar bem os pés. Uma das infecções sexualmente transmissíveis mais recorrentes e importantes, causada por fungos, é a candidíase, decorrente de infecção por Candida albicans, que é uma levedura. Levedura, aliás, é como chamamos fungos que existem na forma predominantemente unicelular, assim com a Saccharomyces cerevisiae, outra levedura não patogênica e conhecida como “fermento biológico”, usada para fazer o pão e a cerveja! Bem ou mal, os fungos estão no nosso dia a dia, e em toda a parte.

Diversos fungos patógenos invasivos têm causado grandes problemas para a saúde humana, em especial de pessoas com o sistema imunológico comprometido, como pacientes com câncer, ou que receberam transplantes de órgãos ou sob tratamento com imunossupressores. Pacientes infectados por HIV também possuem maior chance de serem infectados por um fungo. Já existem até mesmo relatos de fungos patogênicos isolados de pacientes com COVID-19. Entre os gêneros de fungos mais importantes em doenças invasivas estão Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Mucorales e Pneumocytis. C. albicans, que além de causar a candidíase que mencionamos anteriormente, também pode causar uma doença invasiva denominada candidemia, que apresenta altas taxas de mortalidade mesmo quando pacientes são tratados com antifúngicos.

Para tratar adequadamente uma infecção por fungo, é necessário detectar e identificar sua espécie. Para isso pode-se aplicar a técnica de qPCR (um tipo específico de PCR). Em um estudo recente realizado na Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foi aplicada a técnica de qPCR para a detecção de candidíase invasiva. Na área clínica, a técnica permite que o diagnóstico de doenças seja feito precocemente, bem como o acompanhamento da evolução ou da regressão da doença de forma mais rápida e eficiente.

O diagnóstico tradicional, feito com uma cultura partindo do sangue do paciente, tem baixa sensibilidade – ou seja, pode acabar não detectando o fungo invasor – além de um tempo relativamente longo para que a espécie de fungo em questão seja identificada com sucesso e especificidade. A aplicação desse novo método, com qPCR, traria melhorias nesses dois aspectos. Os pesquisadores destacam, no entanto, que o método ainda é um protótipo e que deve ser desenvolvido com mais cuidado para a aplicação clínica na detecção em larga escala de casos de infecção por C. albicans e outras espécies patogênicas, o que otimizaria tratamentos e intervenções clínicas.

Além dos interesses das aplicações da técnica na área da saúde, a agricultura e a indústria de alimentos e bebidas também se beneficiam da técnica. A pesquisa brasileira também aplica amplamente estas técnicas no desenvolvimento da micologia em nosso país. Trouxemos alguns exemplos!

Vamos começar pela área de alimentos. Em algumas situações, qPCR é utilizada em laboratórios de análise de alimentos, visto que é uma técnica altamente específica e sensível. Porém, dentre as dificuldades está o seu alto custo devido à necessidade de mão de obra especializada, insumos, equipamentos e metodologia para a detecção e identificação de determinados microrganismos.

Diversas pesquisas desenvolvidas no Brasil visam o melhoramento da detecção de fungos que contaminam alimentos, como é o caso das espécies Aspergillus niger e Aspergillus welwitschiae, produtoras de micotoxinas, algumas delas tóxicas para os rins e potencialmente cancerígenas.

Pesquisas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), coordenadas pela Dra. Marta Hiromi Taniwaki, que também é pesquisadora do Instituto de Tecnologia de Alimentos da Secretaria de Agricultura e Abstecimento do Estado de São Paulo (Ital/SAA), em colaboração com pesquisadores da Universidade Estadual de Londrina (UEL), estudaram o uso da técnica de qPCR na detecção das espécies citadas acima, obtidas do café. O método desenvolvido possibilita rápida, precisa e sensível detecção das espécies citadas, que são morfologicamente idênticas.

Fungos também constituem importantes patógenos de plantas, afetando assim a extensa agricultura brasileira. Por isso é importante que a técnica de qPCR também possa ser usada para o diagnóstico de doenças na agricultura. No Brasil, há alguns laboratórios que fazem a análise de qPCR para a detecção de doenças importantes em plantas, como é o caso da EMBRAPA, a ESALQ (Universidade de São Paulo, em Piracicaba), o Centro de Cana/IAC e o Centro de Citricultura/IAC, a qual é focada em doenças que causam danos em cítricos, como laranja e limão.

Em uma troca de e-mails com a pesquisadora do IAC, Lais Granato, ela nos contou um pouco sobre a aplicação de qPCR no cotidiano. Na prática, laboratórios de fitopatologia usam a técnica de RT-qPCR para a detecção de vírus de RNA patogênicos, e técnicas de qPCR para a detecção de fungos e bactérias. Aliás, até mesmo a técnica de PCR convencional é usada em muitos casos, como nos explicou Laís (se estes termos estão confusos para você, dê uma olhadinha neste outro artigo). Geralmente, o agricultor leva amostras de frutas ou de folhas para a clínica do IAC procurar por doenças.

Infelizmente, como já foi dito, os insumos e equipamentos que envolvem a qPCR são caros! No entanto, os agricultores precisam desse serviço para ter certeza de que não há doenças escondidas em seus cultivos. Uma das motivações para se pagar um pouco mais por esse serviço envolve a legislação que regula a exportação dos vegetais. Frutas de mesa, quando exportadas para a Europa, precisam obrigatoriamente passar por uma comprovação de que não há presença de alguns fungos e outros patógenos. Um exemplo é Phyllosticta citricarpa nas cascas das laranjas. Este fungo não existe na Europa e a legislação não permite que nada entre sem uma comprovação de que está “limpo”.

Na prática, em algumas situações, mesmo que a detecção pudesse ser feita, questões ligadas ao sistema produtivo podem ser um problema, como a limitação de equipamentos, disponibilidade de equipes de inspeção e de corpo técnico. Mas, além disso, descobrimos algo curioso quando o assunto é priorizar um problema ou outro na agricultura, o que pode deixar os fungos “de lado” e piorar os problemas, como nos contou a pesquisadora do IAC, Dra. Andressa Bini, hoje pós-doc no Centro de Cana do IAC. O exemplo é o fungo Colletotrichum falcatum, causador da podridão vermelha em cana-de-açúcar. Acreditava-se que o fungo infectava apenas plantas a partir de ferimentos causados por uma praga, a lagarta de Diatraea saccharalis. Seguindo este raciocínio, a prioridade no passado era controlar apenas a praga, mas não o fungo em si, que seria uma consequência oportunista. No entanto, a realidade é que os fungos conseguem infectar as plantas mesmo na ausência dessa praga, tornando a detecção do fungo uma prioridade, já que, sem um controle efetivo da doença, podem ocorrer perdas de até 35% da produção e hoje o patógeno já afeta pelo menos as regiões do Triângulo Mineiro, Mato Grosso do Sul e algumas regiões de São Paulo.

Outro exemplo de pesquisa aplicada e com uso de qPCR vem da ESALQ. O eucalipto é uma planta muito importante para a produção de madeira e papel em nosso país. Uma doença fúngica causada por Austropuccinia psidii, a “ferrugem”, é conhecida como problemática para esta cultura. Um grande problema da detecção desta doença é que o fungo é normalmente percebido apenas após o aparecimento de sintomas nas plântulas, quando o problema já é muito grande. Os métodos convencionais utilizados geralmente são pouco eficientes, ou pouco sensíveis. Apostando na qPCR, uma técnica mais sensível, mais rápida e menos laboriosa, pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP), em 2018, propuseram o uso de qPCR para a detecção prematura da doença no eucalipto. Outra aplicação interessante desta análise, sugerida pelos pesquisadores, é a identificação rápida de plântulas suscetíveis ou resistentes à doença em programas de melhoramento.

Como pudemos ver, geralmente as limitações ainda estão no alto custo dessa tecnologia recente, porém as aplicações são muito diversas e ainda há muito para se desenvolver na área. Ainda estamos no começo de uma nova era de análises e técnicas moleculares, e a tendência é que surjam aprimoramentos que tornem essas novas tecnologias mais baratas e aplicáveis com o passar dos anos.

Colaboração:

Rafael Sanchez Luperini sobre o autor

É aluno de pós-graduação (mestrado) pelo programa de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) na Universidade de São Paulo (USP), atualmente orientado pelo Prof. Dr. Gustavo H. Goldman (FCFRP, USP Ribeirão Preto). Trabalha com espécies do gênero Aspergillus, buscando desvendar as diferenças entre espécies de fungos.

Renato Augusto Corrêa dos Santos sobre o autor

É doutorando pelo programa de Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), fazendo análises genômicas de fungos patogênicos do gênero Aspergillus, sob orientação do Prof. Dr. Gustavo H. Goldman (FCFRP, USP Ribeirão Preto) e com financiado da FAPESP. Seu projeto envolve uma colaboração do com o LGE (UNICAMP) e o Rokas Lab (Vanderbilt University, EUA).

Fontes consultadas:

– Artigo científico intitulado “A Real Time PCR strategy for the detection and quantification of Candida albicans in human blood.”, publicado na Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo em 2020, de autoria de Busser, F. e colaboradores.

– Artigo científico intitulado “A New Age in Molecular Diagnostics for Invasive Fungal Disease: Are We Ready?”, publicado na revista Frontiers in Microbiology em 2020, de autoria de Kidd, S. e colaboradores.

– Artigo científico intitulado “Development of a quantitative real-time PCR assay using SYBR Green for early detection and quantification of Austropuccinia psidii in Eucalyptus grandis.” publicado na revista European Journal of Plant Pathology em 2018, de autoria de Bini, A. e colaboradores.

– Artigo científico intitulado “Real-time PCR-based method for rapid detection of Aspergillus niger and Aspergillus welwitschiae isolated from coffee.” publicado na revista Journal of microbiological methods em 2018, de autoria de Von Hertwig, A. e colaboradores.

– Matéria no site da empresa Kasvi intitulada “História e evolução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase)” publicada em 18/06/2015.

– Matéria no site da empresa Kasvi intitulada “Qual a diferença entre PCR e qPCR?” publicada em 30/04/2015.

– Matéria no Blog Biomedicina Padrão intitulada “A evolução da PCR” publicada em 05/12/2013.

– Matéria no Blog Biomedicina Padrão intitulada “Reação em Cadeia da Polimerase – PCR” publicada em 14/06/2020.

– Embrapa.